何华奇^1,2         曹晖²   陈明杰²      潘迎捷²

（¹安徽科技学院 安徽 凤阳233100; ²农业部食用菌遗传育种重点开放实验室;上海市农业科学院食用菌研究所 上海 201106）

摘 要:从美国、波兰和中国收集了10株大球盖菇菌株,对这些菌株进行了同工酶和RAPD分析。从大球盖菇菌株酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳条带聚类分析可以看出，大球盖菇菌株间遗传差异较大，最大的两类之间相似系数仅为0.0096，有5株相似系数在0.5000以下，St2、St4、St5间相似系数在0.5以上，特别是St4和St5相似系数为1.0000。RAPD分析结果显示，20个随机引物中有16个随机引物的扩增效果较好，分别扩增出8-21个条带，共扩增出241条条带，片段大小在180～3100bp之间，这些菌株之间的相似系数用UPGMA进行聚类可以看出，St2、St4、St5在相似系数为0.8248聚为一类，说明它们之间的遗传关系较近，而最大两类之间的相似系数为0.1953，说明大球盖菇菌株间有丰富的遗传多样性，进一步从核酸水平验证了同工酶实验结果。

关键词：同工酶；RAPD；亲缘关系；聚类分析

中图分类号：Q939.96

大球盖菇(Stropharia rugoso-annulata Farlow apud Murrill) ,又名酒红大球盖菇、皱环球盖菇、皱球盖菇、裴氏球盖菇、裴氏假黑伞等(黄年来，1995)，英文名King Stropharia、Garden Giant、Wine-red Stropharia 、Wine Cap Mushroom；在（第八版）《菌物辞典》（Hawksworth & Sutton,1995）的分类系统中，隶属于真菌门（Eumycophyta）、担子菌纲（Basidomycetes）、伞菌目（Agaricales）、球盖菇科（Strophariaceae）、球盖菇属（Stropharia）。大球盖菇1922年首次发现并命名于美国，其后欧洲各国、日本、中国也相继发现其分布(黄年来，1997)。在20世纪60年代，德国开始试种，其后，波兰、捷克斯洛伐克、匈牙利相继引种栽培（颜淑婉，1995）。1980年我国从波兰引种并试栽成功，但没有推广。近几年国内学者对大球盖菇的生物学特性、制种及栽培技术（付江习，1998；许彬，2019；徐来源，2019；），生物活性成分及药理作用（汪虹，2018）进行了较多的研究。本文利用同工酶和RAPD技术研究了大球盖菇菌株的亲缘关系，以期为大球盖菇的栽培和育种工作提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株及培养基

供试大球盖菇(Stropharia rugoso-annulata)菌株编号及其来源分别为St1、St11来源于中国，St2、St4、St5、St7、St8、St9、St10来源于美国，St6来源于波兰,均由上海农科院食用菌研究所提供。培养基为CYM培养基。

1.2 大球盖菇酯酶同工酶的提取和电泳

供试菌株接种于CYM培养基，25℃培养15d。酶蛋白提取方法及电泳均按潘迎捷等（1988）提供的方法进行。聚丙烯酰胺凝胶电泳进行酯酶同工酶分析，分离胶浓度为7.5%，浓缩胶浓度为4%，交联度为2.7%。

1.3 RAPD 分析

DNA提取参考谭琦等（2001）。RAPD反应采用了17种上海生物工程中心合成的随机引物，即S6、S8、S10、S12-S19、S42-S44、S47、S59、S60。

PCR反应体系见表1，反应程序为，92℃变性5分钟，然后92℃变性1分钟，35℃复性1分钟，72℃延伸2分钟，重复此循环45次。最后72℃补平5分钟。反应结束后，取反应产物12μl与3μl 溴酚蓝指示剂混匀，点样于1.2%琼脂糖凝胶上，5V/cm，电泳。EB染色10分钟，自来水漂洗5分钟。用VDS 观察电泳结果并拍照。          

  表 1  PCR混合液成分的加入量及最终浓度

Table 1  Quantity and final concentration of PCR compositions

1.4 聚类分析

统计聚丙烯酰胺凝胶电泳中的同工酶条带和琼脂糖凝胶电泳中的DNA条带，用NTSYS-PC软件中的Simqual程序计算出大球盖菇不同菌株间相似系数，然后用平均连锁聚类分析方法（UPGMA）进行聚类分析，构建遗传相关聚类图谱。

2 结果与分析

2.1 酯酶同工酶分析

2.1.1 酯酶同工酶酶谱

10株不同来源大球盖菇菌株的酯酶同工酶酶谱中共存在18株迁移率不同的酶带，其相对迁移率在0.15至0.91之间，酶带总数为44条，10株大球盖菇菌株酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱及示意图如图1所示。

图1  10株大球盖菇菌株酯酶同工酶酶谱

Fig.1  Schematic map on esterase isoenzyme patterns of 10 isolates in S.rugoso-annulata

2.2.2 酶谱的相似系数和聚类分析

根据大球盖菇酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝胶电泳条带统计表，用NTSYS-PC软件中的Simqual程序计算出不同菌株的相似系数，组成相似系数矩阵，如表3所示。

表2  大球盖菇菌株同工酶图谱相似系数矩阵

Table 2 Similarity coefficient matrix of esterase isoenzyme pattern of isolatesin S. rugoso-annulata

根据表2的数据，用UPGMA聚类法，将10株菌株之间的相似系数进行聚类，构建树状聚类图，如图2所示。

图2  10株大球盖菇菌株酯酶同工酶酶谱树状聚类图

Fig.2  Dendrogram of cluster analysis based on similarity coefficient of 10 isolates in S.rugoso-annulata

从10株菌株之间的相似系数及其树状聚类图可以看出：10株菌株聚成了不同的类，最大的两类之间的相似系数只有0.0096,这说明菌株之间的遗传差异很大；St4和St5间的相似系数为1.0000，来源都是美国，可能是同一菌株，编号不同或本来是同一菌株，后流传到不同的地方；St1，St2，St4，St5，St10聚为一类，相似系数在0.5以上，虽然St1为浙江松阳，但其相似系数之大，说明它与美国的几个菌株具有一定的同源性。

2.2 RAPD分析

2.2.1 RAPD结果统计

利用20个随机引物对10株大球盖菇进行了RAPD分析，结果显示，有16个随机引物的扩增效果较好，条带丰富，重复性好，这16个引物分别可扩增出8-21个条带，共扩增出241条条带，平均每个引物有15.1个DNA扩增片段，片段大小在180～3100bp之间，引物S43、S60扩增产物图谱见图3、图4。

N M St1 St2 St4 St5 St6 St7 St8 St9 St10 St11                   N M St1 St2 St4 St5 St6 St7 St8 St9 St10 St11 

图3  随机引物S59扩增产物图谱                     图4  随机引物S60扩增产物图谱

Fig.3 Map of results amplified by primer S43        Fig.4 Map of results amplified by primer S60

注：N代表对照，M代表Marker，St1-St11分别代表各菌株

2.2.2 10株大球盖菇的相似系数和聚类分析

根据10株菌株以16种引物扩增的DNA条带统计表。用NTSYS-PC软件中的Simqual程序计算出不同菌株间的相似系数，组成相似系数矩阵，如表3所示。

   表3  10株大球盖菇菌株的DNA相似系数

Table 3  DNA similarity coefficient matrix of 10 isolates in S.rugoso-annulata

根据表3的数据，用UPGMA聚类法，将10株菌株之间的相似系数进行聚类，构建树状类聚图，如图5所示。

图5  10株大球盖菇菌株DNA相似系数的树状聚类图

Fig.5  Dendrogram of cluster analysis based on DNA similarity coefficient of 10 isolates

in S. rugoso-annulata

从10个菌株之间的相似系数及其树状聚类图可以看出：菌株St2、St4和St5相似系数在0.8000以上，其亲缘关系较近，St9、St10、St11之间及与其他菌株之间相似系数均在0.5000以下，它们之间的亲缘关系较远。菌株之间具有较大的遗传多样性。

3 结论

3.1大球盖菇菌株间的同工酶分析

通过对10株大球盖菇酯酶同工酶酶谱的聚类分析发现，大球盖菇菌株间存在着丰富的遗传多样性，除St4和St5外，其他菌株间的遗传相似系数最大只在0.5左右不，而St7和St8聚成的一类与其他菌株所成一类间的遗传相似系数只有0.0096，大球盖菇菌株间的过氧化物酶酶谱由于酶带较少，不宜于做检测遗传多样性的生化标记。

3.2大球盖菇菌株间遗传多样性的RAPD分析

17个随机引物对10株大球盖菇菌株DNA进行扩增处241条条带，片段大小在180-3100bp之间，通过树状聚类图可以看出，大球盖菇菌株之间遗传差异较大，St9、St10、St11都在遗传相似系数0.5以下单独为一类，为大球盖菇的遗传育种提供了丰富的材料，选择遗传差异较大的菌株作为亲本，易通过杂交育种选出性状超越双亲和适应性更强的新品种。

4 讨论

4.1 RAPD对10个菌株遗传多样性的分析结果与酯酶同工酶的分析结果基本相同，这进一步从两个结果都证明了10株大球盖菇菌株之间存在着丰富的遗传多样性，只是在菌株之间的相似系数上，同工酶的分析结果大体上都要低于RAPD的分析结果。由此看来，10个菌株在同工酶上表现出更大的遗传多样性。

4.2 RAPD统计结果St1，St2，St4，St5相似系数在0.5000以上，与酯酶同工酶相同，说明从核酸水平和蛋白质水平表现出一致性。但St6和St10在核酸水平和蛋白质水平有一定的差异，可能由于在转录和翻译水平有一定的调节而致。

4.3 通过同工酶和RAPD分析发现大球盖菇菌株间存在着丰富的遗传多样性。通过聚类分析，同工酶酶谱显示大球盖菇菌株间最小的相似系数为0.0096，而RAPD扩增条带显示大球盖菇菌株间最小的相似系数也只有0.1953，说明大球盖菇菌株之间遗传差异性十分明显，育种工作者可根据菌株间的亲缘关系选择亲本进行杂交，从而容易获得性状超越双亲的新的菌株，为大球盖菇的生长提供优良品种。本论文没有涉及子实体的形态结构方面的内容，在以后的研究中将进行这方面的工作。

参考文献

付江习,1998.大球盖菇的特性及栽培技术初报.食用菌［J］,20(6):9

Hawksworth D L,Sutton D C,1995.Aisworth & Biby’s dictionary of Fungi(8^th edition)［M］,CAB International

黄年来主编，1997.18种珍稀美味食用菌栽培［M］.北京:中国农业出版社.38-45

黄年来,1995.大球盖菇的分类地位和特征特性.食用菌［J］,17(6):11

潘迎捷,汪昭月,王曰英等,1988.香菇菌株同工酶的研究食用菌.［J］，（10）6:13-14

谭琦,杨建明,陈明杰等,2001.香菇孢子单核体与原生质体单核体遗传差异分析.中国食用菌［J］，20(6):3-5

汪虹,陈辉,张津京等. 2018大球盖菇生物活性成分及药理作用.食用菌学报［J］,25(4):115-120

颜淑婉,1995.大球盖菇人工栽培研究简报.江苏食用菌［J］,3:2

许彬，2019.玉米秸秆培养大球盖菇栽培种配方比较.食用菌［J］,41(1):32-34;38

徐来源，叶巧丽，姚光伟等．2019.不同秸秆配方栽培大球盖菇试验．浙江农业科学［J］，60 ( 6) : 867-868

Genetic Diversity and PhylogeneticＲelationship Analysis of  Germplasm Resources

in Stropharia rugosoannulata Strains

HE Hua-Qi¹   CAO Hui²   CHEN Ming-Jie²   PAN Ying-Jie²

(¹Anhui Science and Technology University Fengyang Anhui 233100; ²Key Laboratory of Edible Fungus Genetics and Breeding,Ministry of Agriculture,P.R.China; Edible Fungi Institute ,Shanghai Academy of Agricultural Sciences Shanghai,201106 )

ABSTRACT：10 Stropharia rugoso-annulata isolates were collected from America, Poland and China, The dendrogram of cluster analysis based on the PAGE of esterase isoenzyme pattern of similarity coefficient of the isolates showed that the genetic difference between the isolates was bigger, and the similarity coefficient of the two biggest groups was only 0.0096. The similarity coefficient of 5 isolates was below 0.5000; the similarity coefficient of St2, St4 and St5 was above 0.5000 and that of St4 and St5 was 1.0000.The result of RAPD by 20 primers showed that 16 primers could amplify DNA from 8 to 21 bands respectively. The total bands were 241, and the fragments were from 180bp to 3100bp. From the dendrogram of cluster analysis based on DNA similarity coefficient of 10 isolates using UPGMA, St2, St4 and St5 were one group when the similarity coefficient was 0.8248, and this showed their genetic relationship was relatively close. The similarity coefficient of the two groups was 0.1953. Therefore, the genetic diversity of S. rugoso-annulata was abundant. This further verified the result of isoenzyme from DNA level.

KEY WORDS： Isoenzyme,RAPD,Genetic relationships,UPGMA