李 兵¹，杨程英¹，惠爱玲¹，张文成^1*，陈彦^1*

（1.合肥工业大学食品与生物工程学院/农产品生物化工教育部工程研究中心，安徽 合肥 230009；2.安徽大学生命科学学院，安徽 合肥 230601）

摘要： 目的  研究虫草素、腺苷提取物及纯化物对糖尿病小鼠肾脏氧化应激的影响。方法  昆明鼠小鼠56只，随机分为正常对照组、糖尿病对照组、阳性药物对照组、虫草素和腺苷提取物低、高剂量组，虫草素和腺苷纯化物低、高剂量组共7组，每组8只小鼠，使用链脲佐菌素(STZ)制备糖尿病小鼠模型。造模成功后分别灌胃给药6周，测定肾脏皮质中丙二醛(MDA)、NO含量，血清中BUN、Cr和UA的含量和肾脏组织中的抗氧化酶活性。 结果  虫草素和腺苷纯化物高剂量组可降低高血糖引起的肾脏肥大，显著提高糖尿病小鼠肾脏的T-SOD及CAT酶的活性(P<0.01)，显著降低BUN、Cr、UA、MDA及NO的含量(P<0.01)。结论  虫草素、腺苷纯化物高剂量组可以调节肾脏抗氧化酶的活力，改善肾小球率过滤，减少对肾脏的氧化损伤，对糖尿病小鼠肾脏具有一定的保护作用。

关键词：虫草素；腺苷；糖尿病小鼠；氧化应激

Inhibitory effect of cordycepin and adenosine on oxidative stress in kidneys of diabetic mice

Li Bing¹, Yang Chengying¹, Hui Ailing¹, Zhang Wencheng^1*, Chen Yan^1*

1. Engineering Research Center of Bio-Process of Ministry of Education, School of Food and Biological Engineering, Hefei University of Technology, Hefei, Anhui, 230009；2. School of Life Sciences, Anhui University, Hefei, Anhui, 230601

Abstract:  Objective: To investigate the effects of cordycepin and adenosine on oxidative stress and renal function in kidneys of diabetic mice.  Methods: Fifty-six Kunming mice were randomly divided into seven groups as normal control group, diabetic control group, positive drug control group,extract of cordycepin and adenosine low、high dosage group, purification of cordycepin and adenosine low、high dosage group.Except for normal control group, the rest were induced to be diabetes mellitus(DM) mice by injections of STZ. Every group were fed on corresponding diet by intragastric administration. After six weeks,the activities of antioxidant enzymes in renal cortex , including catalase ,superoxide dismutase , glutathione peroxidase and malondialdehyde were measured in the cortex of kidney.  Results: The results showed that the contents of T-SOD and CAT significantly increased, and the kidney index ,the contents of MDA and NO decreased,while diabetic mice treated with purification of cordycepin and adenosine high dosage. Conclusion: Cordycepin and adenosine high dosage can inhibit oxidative stress in kidney and improve renal function in diabetic mice.

Key words：Cordycepin,  Adenosine,  Diabetic mice, Oxidative stress 

糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是临床上导致糖尿病患者死亡的主要微血管并发症之一^[1]。高糖可促进线粒体电子传递链生成的活性氧(ROS)增加自由基的生成，还可损伤机体的抗氧化系统^[2]。近年来大量研究证实糖尿病及其并发症的发生发展与氧化应激的关系密切^[3]。临床与实验研究都发现增强机体抗氧化系统与改善免疫功能可延缓糖尿病肾病进程^[4-6]。虫草素和腺苷是虫草子实体中的两种重要活性成分。虫草素化学式为3´-脱氧腺苷，具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化性、补肾、心脑血管循环等药理作用^[7-8]；腺苷具有镇静、催眠、抑制癫痫、抗炎、调节免疫的作用^[9-10]。本实验拟研究虫草子实体中的虫草素及腺苷对糖尿病小鼠肾脏氧化应激的影响。

1  材料

1.1 实验动物   56只昆明种健康小鼠，雌雄各半，体重(26.5±2.0g)，SPF级，由安徽医科大学动物中心提供。在室温21-23℃，相对湿度50%-60%，光照周期12h/12h环境中适应性喂养1W后用于实验。

1.2 药品及试剂   链脲佐菌素(STZ)为美国Sigma公司产品，购自合肥博美生物科技有限公司。MDA、SOD、CAT、GSH-PX及NO测定试剂盒，均购自合肥博美生物科技有限公司。血糖仪购自三诺生物传感股份有限公司。其他试剂均为国产分析纯。虫草子实体，购自安泰特种农产品有限公司，产地：安徽六安。

2  方法

2.1 虫草素和腺苷提取物的制备

以本实验室响应面法优化得到的虫草素、腺苷的酶法辅助提取工艺条件，来制备提取物，具体操作为：先将虫草子实体真空干燥6h，粉碎后过60目筛，取100g虫草粉按料液比1:24添加蒸馏水，随后按虫草粉质量加入1.80%中性蛋白酶,在42℃提取温度下浸提150min。在此条件下虫草素的提取率为86.45%，腺苷提取率为70.06%。提取物浓缩后，真空干燥，所得浸膏中虫草素纯度为2.98%，腺苷纯度为4.09%。

2.2 虫草素和腺苷纯化物的制备

    以2.1所得的虫草素和腺苷提取物为原料，按照本实验室优化得到的虫草素和腺苷纯化工艺进行纯化物的制备，具体操作为：以NKA-Ⅱ大孔树脂作为分离纯化虫草素和腺苷的材料。向大孔树脂柱中加入pH 8.0的样液50mL，洗脱剂为70%的乙醇水溶液，以流速3VB/h进行洗脱，洗脱剂用量为200mL。在此条件下，虫草素回收率可达到92.0%，纯度32.5%，较纯化之前纯度提高了10.89倍；腺苷回收率可达到82.5%，纯度39.9%，较纯化之前纯度提高了9.76倍。

2.3 动物分组及糖尿病小鼠模型建立

随机取出8只小鼠作为正常对照组，其余小鼠禁食不禁水12h，按照66mg/kg的剂量一次性腹腔注射STZ，正常对照组小鼠注射等体积柠檬酸缓冲液。连续造模1周后，采用血糖仪测定其空腹血糖值。当血糖值≥16.8mmol/L时视为造模成功。将造模成功的小鼠按照体重及血糖值随机分为7组，分别设为：正常对照组，模型对照组，阳性药物对照组，虫草素和腺苷提取物低、高剂量，虫草素和腺苷纯化物低、高剂量，每组8只。阳性药物对照组以30mg/kg·d灌胃给药。虫草素、腺苷粗提物分别以(虫草素含量定)30和60mg/kg·d灌胃，虫草素、腺苷纯化物分别以(虫草素含量定)30和60mg/kg·d灌胃。正常组与模型对照组需灌胃生理盐水，灌胃体积均为30mL/kg·d,共6w。实验期间小鼠自由进食饲料和饮水。

2.4 指标的检测

小鼠处死前禁食不禁水12h，称其体重。在空腹麻醉状态下眼眶后静脉采血，迅速离心后取血清，测定尿素氮、肌酐及尿酸。摘取双肾，去掉包膜后迅速灌洗，滤纸拭干，用电子天平称重。随后精确称取0.2g左右的肾组织，用生理盐水和均质器制成10%的组织匀浆。将制备好的匀浆以5000r/min的转速离心10min，取上清液，于-20℃冷冻保藏。分别检测丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT) 、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性及NO含量。

2.5 统计学方法   

    数据分析采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，同时进行LSD两两比较，以P<0.05为具有统计学意义上的差异。实验结果用x±s表示。

3 结果

3.1 各组小鼠的一般情况观察

在整个实验期间，正常对照组小鼠体重明显增加，精神状态良好，反应灵敏，毛色较为光泽，无死亡。模型对照组小鼠明显消瘦，并且伴随多食、多饮和多尿的现象，精神较为萎靡，反应迟钝，毛色光泽较差。造模失败2只，提取物低剂量组灌胃死亡一只。至实验结束时，阳性药物对照组、纯化物高剂量组、提取物高剂量组精神状态改善明显，尿量减少，体重比对照组明显增加。

3.2 小鼠体重、肾脏指数、血糖指标检测结果

由表1可以看出，第6周实验结束时，与正常对照组相比，糖尿病组小鼠与各治疗组小鼠的体重均显著下降，终末血糖值显著上升，其中糖尿病组与各治疗组小鼠的终末血糖值无统计学差异(P﹥0.05)。相对于正常组小鼠，糖尿病组小鼠的体重降低50.46% (P<0.01)，肾脏指数升高了60.39%(P<0.01)。经灌胃样品后，各组小鼠肾脏肥大指数均显著下降，相对于模型对照组，纯化物高剂量组下降了17.35%(P<0.05)，提取物高剂量组下降了9.99% (P<

0.05)。说明虫草素、腺苷提取物及纯化物可抑制高血糖引起的肾脏肥大，并且纯化组高剂量效果最佳。

表1  实验期间各模型小鼠空腹血糖值和肾脏指数(n=8,x±s)

 注：#，与正常对照组相比，P<0.01；*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组相比较.

3.3 各组小鼠血清中BUN、Cr及UA含量的变化(x±s)

由表2可以看出，与正常组小鼠相比，糖尿病组小鼠血清中BUN、Cr及UA含量显著升高(P<0.01)，分别上升了82.80%，42.49%及42.35%。在灌胃之后，各组小鼠血清中BUN、Cr及UA含量虽未达到正常水平，但相对于糖尿病组，均有不同程度的降低。可以看出，纯化物高剂量组对于降低BUN、Cr及UA含量最为明显，其分别下降了23.08%，20.98%及19.83%(P<0.05)。结果表明，纯化物高剂量组虽未达到阳性药物的治疗效果，但也能够显著改善肾小球的过滤功能。

表2样品对模型小鼠血清中BUN、Cr及UA含量的影响(n=8,x±s)

    注：#，与正常对照组相比，P<0.01；*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组相比较.

3.4 各组小鼠肾脏组织中MDA、T-SOD、CAT、GSH-Px及NO的变化(x±s)

    与正常对照组相比，模型对照组小鼠肾组织中GSH-Px活性、MDA及NO含量显著升高(P<0.01)，CAT及T-SOD活性显著降低(P<0.01)。相对于模型组小鼠，纯化物高剂量组GSH-Px活性、MDA及NO含量显著降低(P<0.01)，CAT及T-SOD活性显著升高(P<0.01)，并且其余各组无显著性差异(P<0.05)。实验结果见表3.

表3样品对模型小鼠肾脏中MDA含量和SOD、CAT和GSH-PX的活力的影响(n=8,x±s)

 注：#，与正常对照组相比，P<0.01；*P<0.05，**P<0.01，与模型对照组相比较.

4  讨论

一般认为，机体内存在两类自由基防御系统，一类是酶促防御系统，包括SOD、CAT和GSH-PX等，另一类是非酶促防御系统，包括维生素C和谷胱甘肽等^[6]。在正常情况下，体内自由基的产生与清除通过自由基防御系统处于平衡状态。但是当机体长时间处于高糖环境时，体内的自由基会大大增加。有研究证明，在糖尿病早期肾脏形态发生改变之前，肾脏中SOD和GSH活性已显著降低^[11]，会使肾脏抗氧化能力下降，从而发生氧化应激，继而形成DN。发生DN时，体内脂质过氧化产物MDA含量会升高。另外，DN早期，肾脏内NO产生量升高与肾小球滤过率增加具有显著正相关性，并可作为一种自由基参与肾脏内过氧化反应^[12]，因此测定MDA及NO含量可以反应肾脏过氧化水平。除此之外，由于BUN、Cr及UA分别为人体蛋白质、肌酸和嘌呤代谢产物，三种物质均由肾小球滤过后排出，故检测其在血清中的含量可直观反映肾小球的滤过功能。

本实验以自主提取及纯化的虫草素和腺苷为原料，通过腹腔注射STZ方法建立糖尿病小鼠模型。经过6周的小鼠灌胃虫草素和腺苷的提取物及纯化物，对治疗后的小鼠的一般情况、体重、肾脏指数、血糖水平及肾功能的相关指标进行检测。结果显示，虫草素和腺苷的提取物及纯化物对降低血清中BUN、Cr及UA的含量，降低肾脏中MDA及NO含量，提高CAT及T-SOD酶活力都有一定的效果。其中，虫草素和腺苷纯化物高剂量组可以显著提高糖尿病小鼠肾脏的T-SOD及CAT酶的活性，降低脂质过氧化产物MDA含量，减少NO的产生量，并且可显著降低BUN、Cr及UA的含量，说明虫草素、腺苷纯化物可改善肾脏的滤过功能。但是与正常对照组相比，模型对照组小鼠肾脏中GSH-Px的活力显著升高，趋势与CAT、 SOD恰好相反。原因可能是糖尿病小鼠体内处于氧化应激状态，GSH-PX被体内过高的自由基激活而出现代偿性的含量增高或活性增强有关。同时本研究也显示出，糖尿病小鼠肾脏组织中的酶促防御体系的抗氧化酶活性失调，自由基反应、过氧化及脂质过氧化反应加剧，使得糖尿病小鼠肾脏组织呈现出氧化应激。

综上所述，虫草素、腺苷纯化物高剂量组能显著抑制糖尿病小鼠肾脏肥大，调节肾脏抗氧化酶的活力，改善肾小球率过滤，减少对肾脏的氧化损伤，对糖尿病小鼠肾脏具有一定的保护作用。但本实验结果也表明，相对于糖尿病组小鼠，虫草素及腺苷治疗组糖尿病小鼠的血糖水平无明显变化，表明虫草素和腺苷不能改变糖尿病小鼠的高血糖。

参考文献

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167.

基金项目：中央高校基本科研业务费专项资金（编号：PA2019GDPK0084）资助

作者简介：李兵，男，硕士研究生，研究方向:农产品生物化工；

* 通讯作者；电子邮箱：zwc1012@163.com、chenyan600@163.com