孙玉军

(安徽科技学院生命与健康科学学院，安徽 凤阳 233100)

摘  要: 研究秀珍菇子实体多糖（PFP）对D-半乳糖（D-Gal）致衰老小鼠的保护作用。通过腹腔注射D-Gal建立衰老小鼠模型，同时灌胃不同剂量的PFP，42天后，采用试剂盒测定小鼠肝、脑组织中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性和丙二醛（MDA）的含量；同时，对小鼠血清谷草转氨酶 (AST)、谷丙转氨酶 (ALT) 、碱性磷酸酶 (ALP)以及脾脏指数、胸腺指数进行测定；HE染色观察肝、脑组织。结果表明，PFP能拮抗D-Gal引起的小鼠衰老，使小鼠肝、脑组织中的CAT、SOD、GSH-Px活性升高，MDA含量降低。与模型组相比，PFP显著降低小鼠血清的AST、ALP、ALT水平，提高脾脏指数和胸腺指数；组织切片显示PFP对小鼠肝、脑损伤具有保护作用。因此PFP具有良好的抗衰老作用，其机制可能与其提高机体的抗氧化能力、增强机体的免疫功能有关。

关键词：秀珍菇；多糖；D-半乳糖；抗氧化；抗衰老

Protective Effect of Polysaccharides from the Fruiting Body of Pleurotus geesteranus against D-galactose-induced Aging Mice

SUN Yujun

(College of Life and Health Sciences, University of Science and Technology of Anhui, Fengyang  233100, China)

Abstract: Anti-aging effect of polysaccharide from the fruiting body of Pleurotus geesteranus(PFP) on the mice models aged by D-galactose was studied In this paper. The aged mice models were established by injection of D-galactose. These mice were simultaneously given by gavage using different doses of PFP. After 42 days, activities of Catalase(CAT), superoxide dismutase (SOD)，glutathione peroxidase (GSH-Px) and content of malondialdehyde (MDA) in serum, liver and brain were measured by using the reagent kits. The serum AST, ALP, ALT, spleen and thymus indexes of mice were determined. The liver and brain were taken to make histological section by HE staining. The results showed that PFP had antagonism effects on the mice aging induced by D-galactose，had an increase of activities of CAT，SOD and GSH-Px, and had a decrease of MDA in serum，liver and brain tissue. Compared with model group, AST, ALT, ALP on serum of PFP group significantly decreased. Meanwhile, mice spleen index and thymus index of PFP samples group can be increase. The tissue slice displayed PFP has protective effects on liver and brain injury induced by D-galactose. In conclusion, PFP has antioxidation and anti-aging effect. The mechanism might be related to improving the antioxidant capacity and enhancing the  immune function in the body.

Key words: Pleurotus geesteranus; polysaccharide; D-galactose; antioxidant; anti-aging

中图分类号：S646.9       文献标志码：A         

食用菌是一类可供食用的大型真菌，味道鲜美，营养价值高，深受消费者的喜爱。食用菌多糖是其一种重要的活性成分。目前研究表明，食用菌多糖具有抗氧化^[1]、抗肿瘤^[2]、抗衰老^[3]、抗突变^[4]、提高机体免疫力^[5]等多种生物功能。

秀珍菇（Pleurotus geesteranus）是人们经常食用的一种菌类，属于真菌门、担子菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属^[6]。目前秀珍菇的研究主要集中在栽培工艺^[7-9]，液体发酵^[10-11]等方面，对于其活性物质—多糖的提取^[12]、抑瘤活性^[13]、抗氧化活性^[14]等方面也有文献报道，但对于抗衰老方面的研究尚未见文献报道。

    本文采用闪式提取、乙醇沉淀制备秀珍菇子实体多糖（PFP），采用小鼠腹腔注射D-半乳糖建立衰老模型，同时灌胃不同剂量的秀珍菇子实体多糖（PFP），通过测定小鼠肝、脑组织中过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性和MDA的含量以及小鼠血清AST、ALP、ALT指标，计算脾脏指数、胸腺指数，并对其肝、脑组织切片进行观察，来探讨秀珍菇多糖的抗氧化和抗衰老功能，为秀珍菇多糖的开发利用提供参考。

1  材料与方法

1.1  材料、实验动物与试剂

秀珍菇子实体：由安徽科技学院食用菌研究所栽培获得。

昆明种小鼠，雄性，体重20±2 g，SPF级，批准号：SCXK(沪)2012-0006，购于上海杰思婕实验动物有限公司。

过氧化氢酶(CAT)测试盒、超氧化物歧化酶(SOD)测试盒、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)测试盒、丙二醛(MDA)测试盒、总蛋白（TP）测试盒  南京建成生物工程研究所；D-半乳糖（D-Gal）、维生素C（Vc）  国药集团化学试剂有限公司；其他试剂均为国产分析纯。

1.2  仪器与设备

JHBE-50T闪式提取器   河南智晶生物科技股份有限公司；V-5000型可见分光光度计   上海元析仪器有限公司；X-22R型冷冻离心机   美国Beckman公司；H-18R型离心机   北京安必升科技发展有限公司；Themo 1510型酶标仪   赛默飞世尔科技（中国）有限公司；BS-200型全自动生化分析仪   深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；Leica 2235型轮转切片机   德国莱卡测量系统设备有限公司；MOTIC BA410型显微摄影系统        厦门麦克奥迪实业有限公司。

1.3  方法

1.3.1  秀珍菇多糖的制备

秀珍菇子实体经冷冻干燥，粉碎机粉碎，过100目筛。取300 g粉末，加入8000 mL 蒸馏水，电子转速8000 r/min，闪式提取器提取2 min，5000 r/min离心10 min，上清液旋转蒸发浓缩至适当体积，加入3倍体积95 %乙醇于4℃冰箱中沉淀过夜，5000 r/min离心10 min，沉淀复溶，冷冻干燥得秀珍菇子实体多糖（PFP）。

经测定PFP的总糖及蛋白含量分别为60.42%、18.91%，与Molish反应呈阳性；易溶于水，不溶于高浓度的乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有机溶剂；与I-KI反应不显示蓝色，因此PFP是一种非淀粉类多糖复合物。

1.3.2  小鼠分组及处理

将60只小鼠适应性饲养一周，随机分成6组，每组10只，分别为：正常对照组、模型对照组、阳性对照组（Vc）、PFP低剂量组（PFP-L）、PFP中剂量组（PFP-M）、PFP高剂量组（PFP-H）。除正常对照组外，其他各组腹腔注射 D-半乳糖60 mg/kg·d bw；正常对照组的小鼠注射相同剂量（60 mg/kg·d bw）生理盐水；低、中、高剂量组分别以 50、100、200 mg/kg·d bw的秀珍菇多糖量灌胃，Vc组每天灌胃50 mg/kg·d bw的Vc，正常对照组及模型对照组则灌胃等体积的生理盐水，持续处理42天。

1.3.3  小鼠实验样本的采集

第42天给药12 h后，称重，采用断颈法处死小鼠，采集血样并解剖，分别提取肝脏、脑，脾、胸腺，滤纸吸干、称重。肝脏、脑组织分成2份，一份于10%福尔马林中固定，用于组织切片观察；另一份按照器官重量（g）：体积（mL）=1：9的比例加入冷生理盐水，剪碎，用玻璃匀浆器冰浴研磨制备10 %的组织匀浆，3800 r/min 4℃离心10 min，取上清液，用于组织生化指标测定。血液于4℃条件下3000 rpm离心10 min，收集血清，用于血清生化指标测定。

1.3.4  生化指标测定

肝、脑组织匀浆的CAT、SOD、GSH-Px活性和MDA含量测定均按照试剂盒说明书的方法进行。

脾脏指数、胸腺指数均按组织的重量（mg）与小鼠的体重（g）的比值来表示。

血清中的AST、ALT、ALP利用全自动生化分析仪测定。

1.3.5  组织切片观察

从固定液中取出肝、脑组织，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，制作石蜡切片，HE染色，中性树胶封片，显微观察。

1.4  数据处理

实验数据采用SPSS18.0软件进行分析，以均值±标准差（Mean±SD）表示，组间均值比较采用单因素方差分析，P<0.05表示差异显著，用a表示，P<0.01表示差异极显著，用b表示。

2  结果与分析

2.1  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px和MDA的影响

不同处理对小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px和MDA含量的影响见表1。由表1可知，正常对照组小鼠肝脏的CAT、SOD活性极显著高于模型组（p<0.01），GSH-Px活性显著高于模型对照组（p<0.05），而MDA含量极显著低于模型对照组（p<0.01），说明造模成功。多糖低剂量组小鼠肝脏CAT、GSH-Px活性较模型对照组略有升高，但不显著，而SOD活性较模型对照组显著升高、MDA含量较模型对照组显著降低（p<0.05）；多糖中剂量组小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px活性较模型对照组均显著升高（p<0.05），多糖中剂量组小鼠肝脏MDA含量较模型组显著下降（p<0.05）；高剂量组、Vc组小鼠肝脏CAT、SOD活性均极显著高于模型对照组（p<0.01），GSH-Px活性显著高于模型对照组，而MDA含量均极显著低于模型对照组（p<0.01）。

表1  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px和MDA含量的影响

Table 1  Effect of PFP on the activities of CAT, SOD, GSH-Px and the contents of MDA in liver of mice

注：与模型组比较，a表示差异显著（ p<0.05）, b表示差异极显著（p<0.01）；下同。

2.2  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠脑CAT、SOD、GSH-Px和MDA的影响

表2  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠大脑SOD、CAT、MDA、GSH-Px含量的影响

Table 2  Effect of PFP on the activities of CAT, SOD, GSH-Px and the contents of MDA in brain of mice

不同处理对小鼠脑CAT、SOD、GSH-Px和MDA含量的影响见表2。由表2可知，正常对照组小鼠脑的CAT、SOD、GSH-Px活性极显著高于模型对照组（p<0.01），而MDA含量极显著低于对照模型组（p<0.01），说明造模成功。多糖低剂量组小鼠脑GSH-Px活性较模型对照组略有升高，但不显著，而CAT、SOD活性较模型对照组显著升高（p<0.05）、MDA含量较模型对照组略有下降；多糖中剂量组小鼠脑CAT、SOD、GSH-Px活性较模型对照组均显著升高（p<0.05），而MDA含量较对照模型组显著下降（p<0.05）；多糖高剂量组、Vc组小鼠肝脏CAT、SOD、GSH-Px活性均极显著高于模型对照组（p<0.01），而MDA含量均极显著低于模型对照组（p<0.01）。

2.3  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响

不同处理对小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响见表3。由表3可知，正常对照组小鼠胸腺指数、脾脏指数显著高于模型对照组（p<0.05），说明造模成功。多糖低剂量组小鼠胸腺指数、脾脏指数较模型对照组显著升高（p<0.05）；多糖中剂量组、高剂量组、Vc组小鼠胸腺指数、脾脏指数极显著高于模型对照组（p<0.01）。

表3  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠胸腺指数、脾脏指数的影响

Table 3  Effect of PFP on Thymus index and Spleen index of mice

2.4  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠血清AST、ALP、ALT含量的影响

不同处理对小鼠血清AST、ALP、ALT含量的影响见表4。由表4可知，正常对照组小鼠小鼠血清AST、ALP、ALT含量显著低于模型对照组（p<0.05），说明造模成功。多糖低剂量组小鼠血清AST、ALP、ALT含量较模型对照组略有下降，但不显著；多糖中剂量组小鼠血清AST、ALP、ALT含量显著低于模型对照组（p<0.05），多糖高剂量组、Vc组小鼠血清AST、ALP含量显著低于模型对照组（p<0.05），多糖高剂量组、Vc组小鼠血清ALT含量极显著低于模型对照组（p<0.01）。

表4 PFP对D-半乳糖致衰老小鼠血清AST、ALP、ALT含量的影响

Table 4  Effect of PFP on the contents of AST, ALP, TG, ALT in serum of mice

2.5  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠肝组织的影响

PFP对D-半乳糖致衰老小鼠肝组织的影响如图1所示。空白对照组肝脏组织结构正常，肝细胞相互连接形成肝板，以中央动脉为中心向周围呈辐射状形成肝小叶，肝细胞之间空隙形成肝血窦。衰老模型组肝细胞内炎性细胞较多，偶见炎性细胞聚集，细胞胞核较大，胞浆疏松；Vc阳性对照组肝脏组织结构正常，显微镜下肝脏组织结构完整，着色较好，细胞结构较模型对照组清晰。PFP低、中、高剂量组肝脏组织结构正常，着色清晰，肝血窦明显，结构完整，细胞界限明显，胞核胞浆未发现异常，形态结构较好。

A.空白对照组；B.模型对照组；C. 阳性对照组；D.PFP低剂量组；E.PFP中剂量组；F.PFP高剂量组

注：图中箭头示炎性细胞

图1  小鼠肝脏组织切片（HE染色,×200）

Fig. 1  Liver tissue slice in mice（HE staining,×200）

2.6  PFP对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织的影响

PFP对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织的影响如图2所示。空白对照组大脑组织结构正常，大脑皮层分子层、颗粒细胞层、锥体细胞层分层较明显；与空白对照组相比较，衰老模型组分子层较对照组厚，细胞分层不明显，锥体细胞数量较少，散落分布；Vc阳性对照组分子层较对照组薄，细胞分层明显，锥体细胞数量较少；PFP低、中、高剂量组大脑分子层明显较薄，细胞分层明显，锥体细胞明显增多，且分子层较Vc阳性对照组薄，锥体细胞层内锥体细胞数量明显较多。

A.空白对照组；B.模型对照组；C. 阳性对照组；D.PFP低剂量组；E.PFP中剂量组；F.PFP高剂量组

注：图中1示大脑分子层，2示颗粒层，3示锥体细胞层；箭头示锥体细胞

图2  小鼠脑组织切片（HE染色,×200）

Fig.2  Brain tissue slice in mice（HE staining,×200）

3  讨论与结论

长期注射一定剂量的 D-Gal，在小鼠体内代谢得到大量的半乳糖醇，不能被进一步代谢因而堆积起来，影响细胞正常的渗透压，导致细胞肿胀，代谢紊乱^[15]。同时，D-Gal在小鼠体内代谢氧化产生大量的自由基，超过机体正常的清除能力，即氧化与抗氧化的动态平衡被打破，使细胞极易受到自由基的攻击从而引起衰老的发生。D-Gal致衰老的过程与机体的自然衰老过程较为相似，因此D-Gal诱导氧化应激导致小鼠衰老，已被广泛应用于抗氧剂、抗衰老药物等的筛选^[16-17]。

MDA 是机体内的自由基引发脂质过氧化的一种产物，常被作为评价衰老的一种指标 ^[18]。SOD是体内一种重要的抗氧化酶，能够有效清除超氧阴离子自由基，降低MDA及自由基代谢产物的产生，使细胞免受破坏。本实验中，秀珍菇多糖的低、中、高各剂量组与模型组相比，肝脏组织和脑组织中的 SOD 活性均显著提高（P<0.01，P<0.05），且呈现一定的量效关系，表明秀珍菇多糖清除自由基的能力较强，阻断自由基的链式反应，能够拮抗D-Gal致小鼠的衰老。与模型组相比，秀珍菇多糖的低剂量组MDA 含量稍有下降，中、高剂量组MDA 含量下降显著（P<0.01，P<0.05），也呈现一定的量效关系，表明秀珍菇多糖减轻了小鼠机体的脂质过氧化程度，延缓衰老。

羟基自由基（·OH）是机体内化学性质最活泼的一种活性氧^[19]，能够损伤细胞，引起衰老。过氧化氢是产生·OH 的前体物质，CAT 可以分解H2O2，减少羟基自由基的产生，延缓衰老^[20]。GSH-PX 也是机体内一种重要的抗氧化酶，它特异性地催化GSH还原过氧化物的反应^[21]。本实验中，与模型组相比，秀珍菇多糖中、高剂量组小鼠肝脏和脑组织中的GSH-PX和CAT活性也均显著提高（P<0.01，P<0.05），且活性随着多糖浓度的升高而增大。表明秀珍菇多糖能够将活性氧自由基和H2O2降解为无毒的H2O和O2，同时促使GSH将过氧化物还原，减少过氧化物量的产生，阻断由过氧化物引发的自由基对机体组织造成的伤害，起到一定的抗衰老作用。

血液中ALT 和AST 活性是肝细胞受损的重要指标之一，肝细胞受损，ALT 和AST便释放入血液中，因此可以根据血清中ALT 和AST 活性的高低来判断肝细胞的损伤程度^[22]。ALT在肝脏中含量最高，AST在心脏中含量最高，其次是肝脏。ALT在肝脏中主要存在于肝细胞质内，AST在肝脏中主要存于肝细胞的线粒体内，当肝细胞受损时，其线粒体膜和细胞膜损伤，血液中ALT和AST活性明显升高。ALP 主要来自骨骼的成骨细胞和肝脏，当肝脏受到损伤时，ALP 经淋巴道和肝窦进入血液，引起血清ALP的明显升高^[23-24]。本实验中，模型组小鼠血清AST、ALT、ALP水平均比正常对照组明显升高，表明D-半乳糖可致小鼠肝细胞受损，产生明显的肝脏毒性，但灌胃不同剂量的秀珍菇多糖组，小鼠血清AST、ALT、ALP 水平均有所下降，表明肝脏毒性减轻，且毒性随多糖剂量的升高而逐渐降低。

机体的免疫功能与衰老过程密切相关，细胞免疫功能低下是导致衰老的重要因素之一。胸腺与脾脏是机体两种重要的免疫器官，胸腺指数与脾脏指数数值的高低能够反映机体胸腺和脾脏免疫功能的状况。与正常对照组相比，模型组Ｄ-半乳糖可导致小鼠胸腺和脾脏等免疫器官萎缩，胸腺组织和脾脏组织发生病理性改变，胸腺指数和脾脏指数降低。与模型组相比，秀珍菇多糖低、中、高剂量组小鼠的胸腺指数、脾脏指数显著增加（P<0.01，P<0.05），表明PFP能够抑制机体免疫器官的退化、增强机体的免疫能力。

本实验研究结果表明，秀珍菇多糖能够显著提高D-Gal致衰老小鼠的肝脏指数和脾脏指数，增强肝、脑组织中的SOD、GSH-PX及CAT 活性，降低肝、脑组织中的MDA含量，证明秀珍菇子实体多糖可显著抑制D-Gal致衰老小鼠机体组织器官的退化，提高抗氧化酶活性、清除超氧阴离子自由基、清除羟自由基等活性氧。综上所述，秀珍菇子实体多糖具有延缓衰老作用，其机制可能与其提高机体的抗氧化能力、增强机体的免疫功能有关。本文对秀珍菇子实体多糖的抗衰老作用进行实验研究，为进一步开发和利用秀珍菇资源提供参考。

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