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亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用
发布日期:2019/11/1 12:44:33


杨锐,李杨丹,王亚,陈娟,陈彦*

(安徽大学生命科学学院,安徽 合肥 230601

 

摘要: 目的 观察亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠心肌损伤的保护作用。 方法 雄性C57BL/6J小鼠随机分为4组:正常对照(NC)组、糖尿病对照(DM)组、糖尿病+多糖低剂量组(DM+LAT)组和糖尿病+多糖高剂量组(DM+HAT)组。采用高糖高脂饮食和多次腹腔注射链脲佐菌素的方法制备2型糖尿病小鼠模型。DM+LAT组和DM+HAT组小鼠每天分别灌胃200 mg/kg400 mg/kg 亮菌多糖。测定各组小鼠心脏功能指标如左心室射血分数(LVEF)和短轴缩短率FS以及空腹血糖值(FBG);测定血清中总甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶(CK)的水平;利用ELISA试剂盒检测心肌组织肿瘤坏死因子αTNF-α)和白细胞介素IL-1β)的含量 结果 NC组比较,DM组心功能指标LVEFFS明显下降,FBGTGTCLDHCKTNF-αIL-1β均明显增高。给予低、高剂量亮菌菌丝体多糖干预后,与DM组比较,DM+LATDM+HAT组中上述指标均明显改善。 结论 亮菌菌丝体多糖可以改善糖尿病小鼠心肌损伤,其机制可能与减少促炎因子释放生成相关。

关键词: 亮菌菌丝体;多糖;糖尿病;心脏;促炎因子

 

Protective effects of polysaccharides from Armillariella tabescens mycelia on cardiac injury in type 2 diabetic mice

Yang Rui, Li Yangdan, Wang Ya, Chen Juan, Chen Yan*

(School of Life Sciences, Anhui University, Hefei, Anhui, 230601)

 

ABSTRACT: Objective To investigate the protective effects of polysaccharides from Armillariella tabescens mycelia (AT) on cardiac injury in type 2 diabetic mice.  Methods Male C57BL/6J mice were randomly divided into 4 groups: normal control (NC) group, diabetes mellitus (DM) group, DM+low dose AT (DM+LAT) group and DM+high dose AT (DM+HAT) group. High-glucose/fat diet and multiple low-doses streptozotocin injections were utilized to induce a T2D model. Mice in DM+LAT and DM+HAT groups were daily gavaged with 200 mg/kg and 400 mg/kg AT, respectively. Cardiac function indexes including left ventricular ejection fraction (LVEF) and shortening fraction (FS), fasting blood glucose (FBG), serum total triglyceride (TG), total cholesterol (TC), lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase (CK) were measured. Tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) in cardiac tissue were detected using ELISA kits. Results Compared with the NC group, LVEF and FS were decreased significantly, while the levels of FBG, TG, TC, LDH, CK, TNF-α and IL-1β were significantly increased in the DM group. Compared with the DM group, the above indicators in the DM+LAT and DM+HAT groups were improved obviously. Conclusion AT can improve cardiac function in type 2 diabetic mice, and its mechanism may be related to the reduction of pro-inflammatory cytokines release.

KEY WORDS: Armillariella tabescens mycelia; polysaccharides; diabetes mellitus; heart; pro-inflammatory cytokines

 

近年来,糖尿病的发病率呈逐年上升趋势。国际糖尿病联盟201512月的数据显示,中国糖尿病患者数已达1.1亿,居全球首位,预测到2040年中国糖尿病患者数将达1.5亿。糖尿病已成为继癌症、心血管疾病后第三个威胁人类健康的重大疾病。糖尿病心肌病是糖尿病严重的并发症之一,是糖尿病患者特有的心肌疾病,由持续高血糖引起心肌细胞损伤,最终导致心功能障碍、心力衰竭[1]。其发病机制复杂,能量代谢异常、炎症反应、氧化应激和细胞凋亡均是其促进因子[2]

亮菌(Armillariella tabescens,因其菌丝体能在暗处发出浅蓝色的荧光而得名,属于担子菌亚门,层菌纲,伞菌目,口蘑科,假蜜环菌属,是一种药食兼用的名贵食用菌[3]。中医认为亮菌味甘性寒,具有疏风活络、益肠胃、清热解毒等保健功能,常用于治疗急慢性胆囊炎、肝炎、阑尾炎等。多糖是亮菌主要的活性成分之一,研究表明亮菌多糖具有提高免疫力、抗肿瘤、消炎、抗菌、防辐射等作用[4-6]。本实验通过观察亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠空腹血糖值、血清中甘油三酯和总胆固醇含量以及心肌炎症因子的影响,探讨其对糖尿病心肌损伤的保护作用,为亮菌菌丝体多糖的新药研发提供实验依据。

 

1 材料

1.1   实验动物  

雄性C57BL/6J小鼠,体重22 ± 2 gSPF级,由安徽医科大学动物中心提供,饲养于室温21-23,相对湿度50%-60%,光照周期12h-12h的环境中

1.2   试剂  

链脲佐菌素购自美国Sigma公司总甘油三酯(total triglyceridesTG),总胆固醇(total cholesterolTC),乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenaseLDH)和肌酸激酶(creatine kinaseCK)测定试剂盒均够自南京建成生物工程研究所;肿瘤坏死因子tumor necrosis factorTNF-α和白介素-1βinterleukin-1βIL-1βELISA试剂盒购自武汉华美生物公司。

 

2 方法

2.1亮菌菌丝体多糖的制备

将新鲜的亮菌菌丝体,用闪式提取仪粉碎,按1:5添加蒸馏水,置于80水浴锅中水浴,每30min搅拌一次,2h后使用八层纱布过滤,收集上清液,滤渣再加蒸馏水,水浴2h,收集上清液,并将两次上清液合并。上清液经旋转蒸发至150 ml,加入4倍体积的无水乙醇4 过夜沉淀。Sevage法除蛋白,得亮菌菌丝体多糖(AT)。

 

2.2 动物分组及模型制备

  雄性C57BL/6J小鼠(体重: 22 ± 2 g),适应性饲养1周后随机分为正常对照(NC)组、糖尿病对照(DM)组、糖尿病+亮菌菌丝体多糖低剂量组(DM+LAT)组和糖尿病+亮菌菌丝体多糖高剂量组(DM+HAT)组,每组8只。除NC组给予正常饲料外,其余三组小鼠均给予高糖高脂饮食(含10%猪油,20%白糖,3%胆固醇,0.2%胆盐)。喂食4周后, NC组小鼠腹腔注射等剂量柠檬酸缓冲液,其余3组小鼠均腹腔注射链脲佐菌素50 mg/kg1周内注射4次,最后一次注射后,72 h后尾静脉采血测空腹血糖fasting blood glucoseFBG,取FBG≥11.1 mmol/L2型糖尿病模型。继续高糖高脂饮食,第9周后,DM+LAT组和DM+HAT组小鼠开始灌胃分别给予亮菌菌丝体多糖溶液200 mg/kg400 mg/kg,每天1次;NC组和DM组小鼠给予等量去离子水灌胃,每天1次,共持续4周。

 

2.3 测定心功能指标和FBG

干预4周后,小鼠经异氟烷麻醉后,将其仰卧位固定在操作台上。使用Vevo 2100 彩色多普勒小动物超声诊断仪测定小鼠心功能指标:左心室射血分数(left ventricular ejection fractionLVEF)和短轴缩短率(shortening fractionFS)。测量结束后,在空腹麻醉状态下眼眶后静脉采血,室温放置30分钟后,离心后取血清。摘取小鼠心脏,用预冷的生理盐水清洗,滤纸拭干。

 

2.4 测定血清TGTCLDHCK水平

取小鼠血清,分别按试剂盒说明书要求,检测血清中TGTCLDHCK水平。

 

2.5 测定心肌组织TNF-αIL-1β水平

取小鼠新鲜心肌组织,制成组织匀浆,分别按试剂盒说明书要求,检测TNF-αIL-1β水平。

 

2.6 统计学处理

  采用SPSS 17.0 统计软件,实验数据以平均数±标准差(± s)表示。各组间采用单因素方差分析,两两比较采用q检验,以P0.05表示差异具有统计学意义

 

3 结果

3.1 心功能指标和FBG测定 

NC组比较,DM小鼠FBG显著增高(P0.01),LVEFFS均显著下降(P0.01)。DM组比较,DM+LATDM+HAT组小鼠FBG均明显降低P0.05P0.01LVEFFS均明显升高(P0.05P0.01,表1

1 各组小鼠心功能指标和FBG比较(n = 8± s

Group

LVEF (%)

FS (%)

       FBG (mmol/L)

NC

81.77±6.17

49.81±4.29

4.65±1.47

DM

58.11±5.10**

33.50±4.32**

21.65±2.12**

DM+LAT

65.95±7.65#

38.02±3.90#

19.66±2.04#

DM+HAT

70.26±6.37##

41.92±4.27##

17.53±1.83##

**P0.01 vs. NC group; #P0.05##P0.01 vs. DM group

 

3.2 血清TGTCLDHCK水平测定

NC组相比,DM组血清中TGTCLDHCK水平明显增高(P0.01);与DM组比较,DM+LATDM+HAT组血清中TGTCLDHCK水平均明显降低(P0.05P0.012)。

2 各组小鼠TGTCLDHCK水平n = 8± s

Group

TG   (mmol/L)

TC (mmol/L)

LDH (U/mL)

CK (U/mL)

NC

0.54±0.05

4.16±0.47

15.30±1.37

0.22±0.09

DM

1.08±0.11**

7.71±0.70**

23.95±2.20**

1.07±0.21**

DM+LAT

0.82±0.08##

6.08±0.53##

21.64±1.99#

0.78±0.16##

DM+HAT

0.74±0.07##

5.73±0.51##

18.23±1.98##

0.64±0.12##

**P0.01 vs. NC group; #P0.05##P0.01 vs. DM group

 

3.3 心肌组织TNF-αIL-1β水平测定

NC组相比,DM组心肌组织TNF-α IL-1β水平明显增高(P0.01);与DM组比较,DM+LATDM+HAT组心肌组织TNF-αIL-1β水平均明显降低(P0.05P0.013)。

3 各组小鼠心肌组织TNF-αIL-1β水平n = 8± s

Group

TNF-α   (pg/mg)

IL-1β (pg/mg)

NC

135.82±13.65

61.92±10.52

DM

262.43±24.30**

121.35±15.24**

DM+LAT

224.67±21.53##

108.49±13.22#

DM+HAT

191.36±20.12##

96.27±8.69##

**P0.01 vs. NC group; #P0.05##P0.01 vs. DM group

 

4 讨论

糖尿病心肌病是由于持续高血糖引起的心脏微、小血管病变,心肌代谢紊乱,最终导致心肌结构损伤、心功能障碍本实验通过利用高糖高脂饮食联合链脲佐菌素诱导2型糖尿病小鼠模型[7],观察小鼠心功能指标-LVEFFS,血清中空腹血糖值、甘油三酯、总胆固醇,以及LDHCK的含量。其中LDHCK两个反映心肌损伤的敏感指标[8]LDH是无氧糖酵解途径中的关键酶, CK是参与心肌细胞能量代谢的关键酶类。当心肌损伤时,血清中LDHCK活性明显升高,且活性增高的程度与心肌损伤程度密切相关[9]本实验结果显示与NC组比较,DMLVEFFS明显下降,FBGTGTCLDHCK含量明显增加,证实了2型糖尿病小鼠复制成功,并损害了小鼠的心脏功能。通过灌胃给予糖尿病小鼠200 mg/kg400 mg/kg亮菌菌丝体多糖溶液干预治疗4周后,实验结果显示:与DM组比较,DM+LATDM+HATFBG值有一定的改善,但是血糖仍超过11.1mmol/L,仍处于高血糖水平。而LVEFFS明显增高,TGTCLDHCK含量明显下降,提示亮菌菌丝体多糖可以改善2型糖尿病,并减轻糖尿病小鼠的心肌损伤。

越来越多的研究表明,2型糖尿病与炎症反应紧密有关[10]亮菌具有重要的抑制炎症的作用[11]。在糖尿病心肌病的发展过程中,炎症因子释放是其重要的促进因素。TNF-α IL-1β是机体中重要的促炎因子,当其释放增多时,会进一步加重心肌的损伤。本实验结果显示,NC组比较,DM小鼠心肌组织促炎因子含量明显增多,炎症反应明显。应用亮菌菌丝体多糖干预后,与DM组比较,DM+LATDM+HAT组小鼠心肌组织中TNF-α IL-1β的释放明显减少,且呈现一定的剂量依赖性提示亮菌菌丝体多糖可以通过抑制糖尿病小鼠心肌的炎症反应,减轻心肌损伤。

综上所述,亮菌菌丝体多糖对2型糖尿病小鼠心肌损伤具有一定的保护作用,其可能的机制是与减轻炎症反应相关。本实验为亮菌菌丝体多糖的开发及利用提供了一定的药理学依据,也为2型糖尿病治疗药物的开发提供一定的实验基础。

 

参考文献:

[1] Zhang X, Chen C. A new insight of mechanisms, diagnosis and treatment of diabetic cardiomyopathy[J]. Endocrine, 2012, 41(3): 398-409.

[2] Falcao PI, Leite-Moreira AF. Diabetic cardiomyopathy: understanding the molecular and cellular basis to progress in diagnosis and treatment[J]. Heart Fail Rev, 2012, 17(3): 325-344.

[3] 李峰,沈业寿. 亮菌多糖ATPS-2对小鼠四氯化碳和酒精肝损伤的保护作用[J]. 中国食用菌, 2007, 26(3): 44-46.

[4] 蔡晶晶,王雅洁,王蔷,宋小平. 亮菌多糖的单糖组成分析及含量测定方法[J]. 长春师范大学学报, 2018, 37(10): 73-77.

[5] T KihoY ShioseK Nagai. Polysaccharides in fungi. XXX. antitumor and immunomodulating antivities of two polysaccharides from the fruiting bodies of Armillariella tabescens[J]. Chem Pharm Bull, 1992, 40(8): 2110-2114

[6] Luo, X., Xu X, Yu M, et al. Characterisation and immunostimulatory activity of an α-(1-->6)-d-glucan from the cultured Armillariella tabescens mycelia[J]. Food Chem, 2008. 111(2): 357-363.

[7] Bansal P, Paul P, Mudgal J, et al. Antidiabetic, antihyperlipidemic and antioxidant effects of the flavonoid rich fraction of Pilea microphylla (L.) in high fat diet/streptozotocin-induced diabetes in mice[J]. Exp Toxicol Pathol, 2012, 64(6): 651-658.

[8] 张艳生,彭良玉,于小华. 硫化氢对大鼠缺血/再灌注心肌损伤的保护作用及机制[J]. 细胞与分子免疫学杂志,2015, 31(3): 316-320.

[9] 康品方,高琴,王晓梅,等. 线粒体融合素2在糖尿病大鼠心肌损伤中的变化[J]. 中国临床药理学与治疗学,2012, 17(4): 398-402.

[10] Tsalamandris S, Antonopoulos AS, Oikonomou E, et al. The role of inflammation in diabetes: current concepts and future perspectives[J]. Eur Cardiol, 2019, 14(1): 50-59.

[11] Lee S, Lee D, Park JY. Antigastritis effects of Armillariella tabescens (Scop.) Sing. and the identification of its anti-inflammatory metabolites[J]. J Pharm Pharmacol, 2018, 70(3): 404-412.

 

 

 

作者简介:杨锐,女,博士研究生,研究方向:多糖的活性与功能研究;

* 通讯作者;电子邮箱:chenyan91030@yahoo.com




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